高通量测序DNA样本建库方法（3）：扩增法

扩增法建库，是指利用PCR方法扩增特定的分子片段，并在扩增过程中引入接头和测序引物区域的建库方法。

其目前在微生物领域应用最广，主要应用在宏基因组测序，用于检测微生物群体的组成结构。主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S /ITS某个高变区域的序列，来反应环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用。

扩增子建库目前市场上一般不收费！不收费！不收费！（重要的事情说三遍）。

和机器打断法、转座酶法动辄每个样几百块钱的建库费用比起来，可以节省一大笔开销。

为啥不收费呢？

原理上说，扩增子建库的过程其实就是PCR过程，实验成本主要是酶和引物，相对成本较低。

其操作过程目前主要有2种流程选择（一步法建库和两步法建库）。

一步法建库是指通过一轮PCR反应，同时进行16S扩增和接头连接的工作，如下图a所示。

两步法建库是指通过两轮PCR反应，分别进行16S扩增以及接头连接的工作，如下图b所示。

原理上很简单，成本很便宜。

那么，是否扩增子建库就可以替代其他两种建库方法了呢？非也！

1、扩增子测序只能检测样本中某一或几个特定基因片段，而并非所有的基因。建库过程中经过了PCR富集和筛选，将研究者所感兴趣的片段几万几十万倍的放大。好处是，研究有针对性，有的放矢；缺点是，信息不全面，例如，只能检测样本中某种菌的有无，却不可能检测其耐药性或毒力。

2、扩增子建库过程中，受酶、扩增循环数等诸多因素的影响。最终检测的微生物群体组成和样本中真实状态会有一定的偏差。基本上，样本起始浓度越高，建库循环数越大，实验中采用的酶越便宜，实验结果与真实情况偏差越远。（关于这方面，感兴趣可以翻笔者之前的贴子“【好文共赏】一管窥豹，SOP标准化在宏基因组研究中的重要性”）

微微碎碎念: 扩增子测序适合进行宏基因组测序，例如粪便、痰液、土壤等。其成本较低，易于开展，值得注意的是，其结果极易受实验操作的影响，容易产生假阳性结果，因此，建议实验过程一定要注意标准化！

疾控系统人员可参照CDC高通量测序实验技术建议方案（2015版），详见”阅读原文“或与笔者联系。